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2024年4月25日发(作者:施仲衡)

鸡膝软骨质量标准 篇一

鸡膝软骨质量标准

摘要:

I.引言

- 鸡膝软骨的定义和特点

II.鸡膝软骨质量标准的重要性

- 与食品安全和人体健康的关系

- 国内外相关标准和法规

III.鸡膝软骨质量标准的内容

- 原料要求

- 加工过程要求

- 成品要求

- 包装和储存要求

IV.鸡膝软骨质量检测的方法

- 感官检验

- 理化检验

- 微生物检验

V.鸡膝软骨质量标准的实施

- 生产者的责任和义务

- 监管部门的职责

- 消费者权益保护

VI.结论 - 鸡膝软骨质量标准对行业的影响

- 未来的发展趋势和挑战

正文:

I.引言

鸡膝软骨,是指鸡膝关节部位的软骨组织,其形状如牙签,质地柔韧,口感脆爽,是一种常见的食材。在食品加工过程中,鸡膝软骨常被用于制作牙签鸡膝软骨串等烧烤类食品。然而,由于鸡膝软骨在动物体内起到支撑和保护作用,可能含有较高的激素和抗生素残留,因此,对其质量进行严格控制,对保障食品安全和人体健康具有重要意义。

II.鸡膝软骨质量标准的重要性

鸡膝软骨质量标准对于保障食品安全和人体健康具有重要意义。一方面,鸡膝软骨作为食品原料,其质量和安全直接影响到食品的口感和品质;另一方面,鸡膝软骨中的激素和抗生素残留可能对人体健康产生不良影响。因此,制定和执行鸡膝软骨质量标准,可以有效保障食品的安全性和卫生质量,确保消费者的饮食健康。

此外,鸡膝软骨质量标准也是国内外市场贸易的技术壁垒之一。我国加入世界贸易组织后,需要遵守国际通行的食品安全和卫生标准,才能顺利开展国际贸易。因此,制定符合国际标准的鸡膝软骨质量标准,对于推动我国鸡膝软骨产品走向国际市场具有重要意义。

III.鸡膝软骨质量标准的内容

鸡膝软骨质量标准主要包括原料要求、加工过程要求、成品要求、包装和储存要求等方面。 1.原料要求

- 鸡膝软骨应来自健康的鸡只,无疫病、无寄生虫感染;

- 鸡膝软骨应具有正常的色泽、气味和口感;

- 鸡膝软骨中的激素和抗生素残留应符合国家相关标准。

2.加工过程要求

- 鸡膝软骨应经过充分的清洗和消毒处理;

- 加工过程中应避免交叉污染,确保产品卫生质量;

- 加工设备和环境应保持清洁,定期进行消毒。

3.成品要求

- 鸡膝软骨成品应具有整齐的形状、均匀的色泽和良好的口感;

- 成品中不应含有杂质、异味和有害物质;

- 鸡膝软骨成品的包装和标签应符合国家相关法规和标准。

4.包装和储存要求

- 鸡膝软骨应采用密封包装,防止水分蒸发和污染;

- 鸡膝软骨应储存在干燥、通风、避光的环境中,避免高温、潮湿和污染;

- 鸡膝软骨的保质期应符合国家相关标准。

IV.鸡膝软骨质量检测的方法

鸡膝软骨质量检测主要包括感官检验、理化检验和微生物检验三个方面。

1.感官检验

- 观察鸡膝软骨的形状、色泽、气味和口感,判断其品质是否合格;

- 检查鸡膝软骨包装和标签是否符合国家相关法规和标准。 2.理化检验

- 测定鸡膝软骨中的水分、蛋白质、脂肪等营养成分;

- 检测鸡膝软骨中的激素和抗生素残留,是否符合国家相关标准。

3.微生物检验

- 检测鸡膝软骨中的细菌总数、大肠菌群、致病菌等微生物指标,判断其卫生质量是否合格。

V.鸡膝软骨质量标准的实施

鸡膝软骨质量标准的实施涉及生产者、监管者和消费者三个方面。

1.生产者的责任和义务

- 生产者应严格按照鸡膝软骨质量标准进行生产,确保产品质量;

- 生产者应建立完善的质量管理体系,对产品进行自检和抽检;

- 生产者应主动接受政府部门的监督检查,配合监管部门的工作。

白酒和它泡着用,专治膝盖疼痛,连骨科医生都称赞多亏了它 篇二

白酒和它泡着用,专治膝盖疼痛,连骨科医生都称赞多亏了它

秋冬季冷热交替,非常容易发生关节疼痛,使得人非常的难受,有很多人觉得纳闷,到底是什么原因导致关节出现疼痛的?且听小编道来。

引起膝盖疼的原因有哪些?

1肥胖惹的祸

膝盖为身体承受重力的重要关节,当我们的体重增加后,对膝盖的压力也增加,从而加重了膝盖的负担。造成膝盖的耐压性降低,导致周围的血管、神经、肌肉过度受压,久而久之则会引起膝盖痛。因此越是肥胖疼痛就会越厉害。

2经常受凉、受寒

我们要知道,膝盖疼可能与寒冷的刺激有关。当膝盖长时间受到寒潮刺激后,引起周围皮肤温度降低,周围血管收缩,膝盖组织血液供血减少,血中的尿酸成分沉积,诱发疼痛。因此,在日常生活中我们要注意保暖,特别是季节变化,必要时可以戴护膝。疼痛时,也可以热敷缓解。

3慢性劳累

其实膝盖疼痛也与我们日常习惯有关,例如长期姿势不良、长时间负重、用力、过度牵拉、运动过度等都有可能造成膝关节韧带拉伤,或者磨损,从而引发膝盖疼痛。常见于运动员、舞蹈家、长期处于站立的工作岗位的员工。因此,要适当放松膝关节,使其得到好的休息。

4缺钙导致

当膝盖软骨缺乏钙质时,会出现骨质疏松,骨质变薄变僵,承受压力的耐受性也相应减弱;此时若过度的劳累或过重局部压力,就会引起疼痛。因此就要及时治疗骨质疏松,补充钙,配合医生治疗。

5外伤后遗症

日常生活中我们难免会遇到受伤,但是往往对一些小的并不在意,在受到外界刺激后,就会引起膝盖疼痛。一般一些原发病治疗好了,疼痛就会渐渐消失。

6膝关节病

当然引起膝盖疼痛的原因还有我们常常听说的一些疾病,如骨关节炎、滑膜炎、风湿性关节炎、痛风、骨刺等原因。因此早发现早就医早治疗。

花椒泡酒治膝盖痛苦,连骨科医生都称赞它

所需材料:一两花椒、半斤高度白酒、半块鲜姜。

做法:把一两花椒磨碎,然后加入生姜泡到半斤的白酒里,泡两天。

方法:

1、先把花椒酒倒在手上使劲搓弄腿,发红发热,不停地敲打,直到把膝盖痛苦的地方都敲打红,暖洋洋的感觉。

2、再敷上一个热水袋,用毛巾包住,不要烫到,敷一端时刻,感觉里边暖洋洋的,很舒畅啊!腿也不疼了。每天坚持2次即可。

花椒——温中散寒,有除湿,止痛,杀菌等成效。《本经》:主风邪气,温中,除寒痹,坚齿发,明目。主邪气咳逆,温中,逐骨节皮肤死肌,寒湿痹痛,下气。《药性论》:治遍身四肢顽痹,口齿浮肿摇摆。

白酒——主要成分是水和酒精,并含有极少量的钠、铜、锌,白酒的成效比较多,具有活血通脉、增进胃口、消除疲惫、御寒提神的成效。

白酒花椒具有很好的温通散寒、除湿止痛作用,能扩张血管。加入白酒炮制,更增强花椒温通发散寒湿之气。

膝关节软骨损伤的原因及治疗 篇三

膝关节软骨损伤的原因及治疗

膝关节是人体结构最复杂的关节,也是人体最重要的承重关节。在医学临床上,膝关节软骨损伤是一种常见的损伤性疾病。随着我国科技的日新月异和人口老龄化的快速发展,膝关节软骨损伤的患者越来越多,作为人体中最重要的一个关节,一旦损伤将给患者的心理和生理带来不同程度的伤害。因此必须及时采取措施医治,帮助患者尽早恢复健康。

1.膝关节软骨损伤的原因

膝关节是作为在人体中最为复杂且最大的滑膜关节,其主要是由骸骨和股骨远端以及胫骨近端、骸骨周围的半月板等部分组成。而膝关节软骨是由关节面软骨和半月板组成,膝关节软骨十分具有弹性,摩擦因数小,而且是一层覆盖在表面的结缔组织,能吸收骨节中的震荡。膝关节软骨损伤的原因简单概括起来就是运动暴力、运动疲劳。运动过度会使膝关节软骨组织出现疲劳状态,运动强度增加会使膝关节的稳定性减弱,随之抵抗外力的能力就会低于正常水平,使得膝关节损伤的几率大大增加。据有关资料显示绝大多数患者都是因为运动不当导致,而且从事体力劳动者和运动员居多。另一部分为老年人,在男性中更为常见,患者在运动中损伤的类型较多的主要分为韧带损伤和膝关节骨折以及膝关节软骨损伤。当患者受伤后会感觉膝关节伸直困难而且伴有剧烈疼痛,膝关节肿胀。对于此,本文将研究膝关节软骨损伤的原因及其治疗方法,将此作为重点关注的问题来展开论述。

2.治疗方法

2.1手术治疗

患者一旦被确诊为膝关节软骨损伤,传统的治疗方法是摘除,关节融合或关节置换,但这些方法往往会严重损伤运动员成绩和运动寿命,因此近年来人们一直致力于新技术的研究即组织工程学来治疗运动性膝关节损伤,简单概括来说就是将带有特定组织的活细胞和特殊的生物材料,将这些生物复合材料移植到损伤的关节和软骨处,以实现软骨的修复和重建。其疗效则取决于选择的修复材料的生物相容性。

聚乙烯醇水凝胶目前普遍认为是最好膝关节软骨的替换材料,在物理性质方面比其他任何人工合成材料更像活体组织,首先其扩展特性和对水分子等的透过性使得生物相容性更加优良,其次良好的柔韧性和高弹性能够减少对周围细胞和组织的机械性刺激,聚乙烯醇具有材料和关节软骨具有类似的基本结构。再者聚乙烯醇水凝胶具有与人关节软骨相似的力学功能。因此,聚乙烯醇水凝胶目前普遍被认为是膝关节软骨良好的代替材料。

聚酰胺66是一种具有高强度、高韧性和良好稳定性的聚合物,聚酰胺66分子构型与自然骨中的胶原极其相似,有利于组织细胞的生长,复合n-HA的多空网状结构适合纤维组织,骨组织长入,形成牢固的生物自锁固定,有效的防止植入体随着时间的推移而发生移动错位。聚酰胺具有良好的组织相容性和血液相容性,高拉伸强度和断裂伸长率,良好的耐磨损、抗曲挠性、耐水解性、耐微生物,容易成型加工,性能可控等优异的性能。

而治疗膝关节软骨损伤的另一种方法则为镶嵌式骨软骨移植术,它所提供的骨软骨移植条块,包含了软骨、松质骨,保持了软骨与软骨下松质骨紧密连接和完整性,植入受区后,骨软骨移植条块的松质骨部分很快的与受区的骨洞松质骨融合,使软骨供血不会中断。自体镶嵌式骨软骨移植术的优点在于骨组织的血运丰富,能很快愈合,有利益软骨细胞的生长,移植软骨取材简单、骨块稳定,软骨下骨有足够的强度以维持膝关节软骨的完整,不需内固定,避免二次手术,避免了由异体软骨发生的排斥反应和疾病的传播,自体骨软骨移植治疗膝关节软骨损伤效果显著,是膝关节软骨损伤修复的好方法之一。

2.2非手术治疗

中医学者经过多年临床实验认为对膝关节软骨损伤患者采用点穴经筋疗法治疗也是一种疗效极好的治疗方法。

首先用分筋、理筋手法对膝关节前、内、外侧、大腿后侧等继发性软组织损伤形成的筋结进行分筋、理筋解痉止痛。其次用揉法、拿法、叩法放松膝关节、大腿、小腿、前内外侧周围软组织。再次对患者侧股四头肌、髌周、下肢后侧等采用揉法、拿法等手法舒缓肌筋、解除痉挛。最后采用点法、按法点、按梁丘、足三里、血海、陵泉、环跳等穴位以此来疏通筋络。运用捏拿法促进关节腔积液吸收。以上手法持续每天20分钟,一天两次,共治疗4个月。治疗期间禁用其他可能影响治疗膝关节软骨的药物或措施,比如消炎止痛药、激素、理疗等。同另一方面要对患者进行及时的心理疏导,要勇于面对困难,以积极乐观的心态去对待疾病,树立战胜疾病的信心,同时也要倾听患者的诉求,尊重患者的隐私,告知患者及其家属此疾病并不是不可战胜的,需要耐心对待此病,保持愉悦的心情,这也是一个不失为对膝关节软骨损伤患者有效的治疗方法。

3.总结

膝关节软骨损伤是一种常见的骨科疾病,具有较高的发生率,患者一旦患上此病,需及时诊断治疗,否则会严重损害患者的日常行走能力,降低患者的生活质量,损害患者的身心健康。虽然膝关节软骨损伤的治疗还存在许多重点和难点问题还有待探索,但是随着科技的发展越来越多的新型材料的研制与开发和新技术的不断更新,研究者对于膝关节软骨损伤的治疗方法也是在逐年进步,这是对膝关节软骨损伤患者的治疗也是十分有益的,可尽早恢复患者健康。

半月板损伤疼得难受?白醋配艾草,用一个好一个,万人验证! 篇四

半月板损伤疼得难受?白醋配艾草,用一个好一个,万人验证!

可能你是一个运动爱好者,突然某一天发现膝盖隐隐作痛;

可能你只是一个上了岁数的中年人,觉得膝盖一天不如一天;

可能你的膝盖受到过一些不大不小的伤,之前反反复复不在意现在却越来越有感觉;

可能你现在膝盖已经明显疼痛,已经出现上下楼梯困难;

可能现在你的膝盖问题已经严重影响到你的生活,你上个月刚辞了职专心康复;

可能你的体重因为膝盖增加,腰也因为膝盖有些不舒服了,可能你的心理也因此受到了极大的影响......

膝盖问题,牵一发而动全身。

膝关节的退行性改变是一个不可逆的过程,而在膝关节中,最早出现老化的部位是髌骨和股骨滑车之间的关节软骨,它的作用是加强伸膝盖的力量。但当下肢用力伸直的过程中,这个部位就会产生很大

的摩擦,当磨损积累到一定程度后,不管有没有外伤,都会损伤软骨。

以半月板损伤为例

半月板是股骨和胫骨之间的纤维软骨环,四周厚中间薄,上面稍呈凹形,以便与股骨髁相吻合,下面为平的,与胫骨平台相接,增加了膝关节的稳定性。

内侧半月板较大,呈“C”型;内侧半月板与内侧副韧带相连;由于内侧半月板较外侧者薄;股骨内侧髁及其关节面积比外侧者大,且有一定的旋转度。

故内侧半月板较多时间处于摩擦,受压和移动状态。

半月板损伤的危害主要体现在以下五个方面:

一:神经疼痛:神经疼痛常见内侧半月板手术后,损伤隐神经髌下支产生神经瘤引起,明确切除后初瘤体症状即可消失。

二:半月板损伤会致使关节肿胀、疼痛:并且发病部位的身体功能严重受到影响,男人半月板损伤的危害有哪些?更甚者导致患者不能正常的工作和学习。

三:肌肉萎缩:以股四头肌为主。由于半月板的损伤,膝关节活动受限,日久肌肉产生了废用性萎缩;肌肉萎缩越严重,下肢无力现象亦越明显。

四:行走不便:半月板因长期磨损或急性损伤而破裂后,男人半月板损伤的危害有哪些?即部分或完全丧失了其原有的功能,甚至在 关节内形成干扰,出现关节交锁、弹响,影响膝关节的正常运动,造成行走不便的困扰。

五:关节积液:关节积液可因操作粗暴、止血不彻底或术后下地负重活动太早引起。一般加强股四头肌抗阻力等张收缩,避免伸屈膝活动,晚负重即可消退。如积液较多,可在严格无菌操作下抽出液体后用弹力绷带加压包扎。

六:关节感染:原因可为操作不当活体内有感染灶。处理的方法是早期在全身应用抗生素的同时,穿刺排脓,男人半月板损伤的危害有哪些?用含抗生素的溶液冲洗。晚期病人需切开排脓,冲洗干净后用抗生素溶液冲洗,停止关节活动,带感染消退后再开始活动,切不可大意。

白醋配艾草,治疗膝盖半月板损伤

做法:取艾叶60克、生姜15克、生葱2-3棵、白醋适量。

将前3味药捣烂,用布包好。然后,将其蘸热酒,涂擦患处。一般关节病患者,涂上一、两次,就不再疼了。

研讨证实:艾草对膝盖骨疼的医治具有很大的影响。

近十几年来,艾草在纾缓痛苦悲伤、辅佐医治枢纽炎上的后果倍受注目。 依据迈阿密大学实行的一项尝试陈述指出,艾叶关于膝盖痛苦悲伤具有改进后果,将261位退步性枢纽炎患者,分为天天摄取生姜萃取物的组别另有没有摄取的组别,察看了6周的痛苦悲伤水平转变,后果发现有摄取的组别均匀增加了4成的痛苦悲伤。

日本综合医讲座特任教授渡边先生也表示,艾叶具有抗发炎的效果,对膝盖痛苦悲伤也有疗效。渡边传授还提出了艾叶的另一种或许性,膝盖中假如临时持续发炎,就会招致软骨遭到破坏,放着膝软骨的发炎不论,就会让软骨垂垂磨损增加。

艾叶滑膜型贴

膏贴贴敷疗法是对付半月板损伤最安全的疗法,它是选用纯艾草熬制的膏贴贴在患处,达到治疗目的。中药膏贴的成分很复杂,直接贴敷患处后,药力可以渗透皮肤,进入患处的软组织和骨骼,对软组织进行消炎止痛,从而解除对神经的压迫,从而达到治疗的目的。

中医提倡“内病外治”“骨病外贴”。艾叶滑膜型贴治疗半月板损伤的常用贴剂。贴敷感觉是:整体先凉后热,20分钟见效,持续发凉20分钟然后发热1-3个小时(各患者贴敷感觉、位置不同表现不同)。发凉时区患者首先感觉冰凉、舒适,其次刺激病症部分达到镇痛效果。发热时区能使患处快速止痛,并对患处活血化瘀,打通血脉从而使中药成分快速有效吸收,最终达到调气血、通经络、散寒湿,消肿痛止痛长期治疗之效果。而且不管是上班还是在家使用都非常方便,随时随地都可以贴一贴。

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA. 篇五

中国组织工程研究

第18卷

第51期 2014–12–10出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 10, 2014 Vol.18, No.51

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

孙志涛1,牛 维2,何升华1,林定坤2 (1深圳市中医院,广东省深圳市 518000;2广东省中医院骨三科,广东省广州市 510120)

文章亮点:

1 目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法,常见的有Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法,国内文献报道多为经典Trizol法。作者在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要,为了解决这个瓶颈,作者尝试了各种方法。

2 比较目前文献报道的常见3种不同方法提取的软骨组织RNA,结果显示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,并能成功反转录合成双链cDNA。

关键词:

组织构建;软骨组织构建;软骨;RNA提取;大鼠;国家自然科学基金

主题词:

软骨;RNA;大鼠

基金资助:

国家自然科学基金项目(81173285)

摘要

背景:目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法,国内文献报道多为经典Trizol法,在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要。

目的:探索不同方法提取SD大鼠软骨组织总RNA的区别。

方法:选取3月龄SD大鼠9只,分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法对软骨组织进行总RNA提取,并通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,以探寻软骨总RNA最佳提取方案。

结果与结论:Trizol法提取的RNA A260/A280值为1.58,说明纯度不高;RNAout法提取的RNA,由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原,也不能满足后续实验的需要;RNeasy® Mini Kit法和肝(Trizol)法提取RNA的A260/A280值分别为2.00和1.98,说明提取的总RNA或核酸的纯度高。RNA的完整性电泳结果显示,RNeasy® Mini Kit法、RNAout法和肝(Trizol)法可见28 s、18 s及5 s条带,而Trizol法未见任何条带,RNAout法28 s和18 s条带不清楚。结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,并能成功反转录合成双链cDNA,而RNAout试剂盒和经典Trizol法获得的总RNA不能满足后续实验需要。

孙志涛,牛维,何升华,林定坤.不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA [J].中国组织工程研究,2014,18(51):8201-8205.

Different methods to extract total RNA from the knee cartilage tissue of

Sprague-Dawley rats

Sun Zhi-tao1, Niu Wei2, He Sheng-hua1, Lin Ding-kun2 (1Shenzhen Hospital of Traditional Chinese

Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China;

2Third Department of Orthopedics,

Guangdong

Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China)

Abstract

BACKGROUND: Currently, there are many methods to extract cartilage RNA reported in the literature, and

classic Trizol method has been mostly reported in China. However, it is discovered that RNA extracted by the

Trizol method cannot meet the needs of the follow-up experiments.

OBJECTIVE: To explore the difference of different methods to extract total RNA from the cartilage tissues of

Sprague-Dawley rats.

METHODS: Nine Sprague-Dawley rats of 3 months old were selected to extract total RNA respectively by

Rneasy Lipid Tissue Kit, RNAout kit and classic Trizol method. Agarose gel electrophoresis was used to detect

RNA integrity in order to explore the best extraction scheme of total RNA.

RESULTS AND CONCLUSION: When Trizol method was used to extract RNA, the A260/A280 value was 1.58,

indicating that the purity was not high. Due to a large number of proteoglycan and collagen in the cartilage, RNA

extracted using RNAout method cannot meet the needs of the follow-up study. When RNeasy® Mini Kit and liver

method (Trizol) were used to extract RNA, the A260/A280

values were 2.00 and 1.98, respectively, indicating that

the extracted total RNA or nucleic acid had high purity. The RNA electrophoresis results showed that using

RNeasy ®Mini Kit, RNAout and liver method (Trizol), 18 s, 28 s and 5 s stripes were visible; but there was no

stripe using Trizol method. For RNAout method, 28 s and 18 s stripes were unclear. These results show that the

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

孙志涛,男,1978年生,安徽省淮南市人,汉族,2013年广州中医药大学毕业,博士,主要从事脊柱、髋膝关节退行性变研究。

doi:10.3969/.2095-4344.

2014.51.001

[]

中图分类号:R318

文献标识码:A

文章编号:2095-4344

(2014)51-08201-05

稿件接受:

2014-10-29

Sun Zhi-tao, M.D., Shenzhen

Hospital of Traditional Chinese

Medicine, Shenzhen 518000,

Guangdong Province, China

Accepted: 2014-10-29

8201 孙志涛,等.

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

total RNA obtained by the Rneasy Lipid Tissue Kit has the high purity, integrity and stability, and can successfully

synthesize double-stranded cDNA by reverse transcriptase, but RNAout kit and classic Trizol methods cannot meet the

need of subsequent experiments.

Subject headings: cartilage; RNA; rats

Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81173285

Sun ZT, Niu W, He SH, Lin DK. Different methods to extract total RNA from the knee cartilage tissue of Sprague-Dawley

rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(51):8201-8205.

0 引言 Introduction

聚合酶链反应(PCR)技术是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法,自从20世纪80年代,Kary Mullis发明了该技术,便广泛应用于分子生物学研究中,以便在分子水平上阐明细胞活动的规律,揭示生命的本质。高质量总RNA的提取是该技术有效开展的必要前提。总RNA的抽提方法有多种,目前实验室常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法,Trizol是使用最广泛的RNA抽提专用试剂,它可以迅速破坏细胞结构,使存在于细胞质和细胞核内的RNA释放出来,并使核糖体蛋白与RNA分子分离,还能保证RNA的完整[1]。随着实验要求的提高,为了从某些特殊组织中获取高质量总RNA,RNA抽提试剂盒应运而生,为实验研究提供了更大的方便。

软骨作为研究关节相关疾病的重要组织之一,其总RNA的有效提取对后续实验的进行起到关键性的作用,由于软骨的细胞含量低,且其细胞基质中含有大量的蛋白聚糖,提取RNA时,这种多糖的凝胶状沉淀与RNA相混[2],使得RNA很容易随着多糖一起被去除,降低RNA的提取率[3]。作者查阅了相关文献,发现以往文献中并未详细报道软骨的取材及RNA的抽提过程,也没有任何一种软骨RNA抽提的标准方法[4-5]。作者在预实验过程中发现,软骨RNA极易发生降解,且经典的Trizol法提取RNA并未像以往报道的那样,能够保证RNA的纯度和完整性,所以,设计此研究方案,通过采用不同的取材和提取方法,来摸索软骨总RNA的最佳提取方案。

1 材料和方法 Materials and methods

设计:单一样本观察。

时间及地点:实验于2012年10月至2013年1月在广州中医药大学国家重点中医骨伤科学实验室完成。

材料:

实验动物:选取3月龄SD大鼠共9只,雌性,体质量(200±20) g,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(粤) 2006-0015。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法:

制作膝骨性关节炎模型:采用经典Hulth方法制作膝骨性关节炎模型[6]。

将SD大鼠左侧膝关节内侧副韧带切断,切除前后交叉8202

提取SD

大鼠膝关节软骨组织总RNA实验的试剂及仪器:

试剂及仪器

来源

Trizol(Invitrogen)

,RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN公司

软骨RNAout

北京天恩泽

T100型梯度

PCR仪、ChemiDocTMMP System凝胶成像仪 Bio-Rad,美国

转化生长因子

β1引物 Invitrogen Trading5804R

型低温超速离心机 eppendorf,德国韧带和内侧半月板。术后常规肌肉注射青霉素,20×104 U/只,连续3 d。造模后4周,断颈处死大鼠,取关节软骨组织,-80 ℃保存。

软骨总RNA提取:

第1种方法:将软骨组织放于研钵中,在液氮下研磨成粉状,加入Trizol研磨(50 mg的组织加1 mL的Trizol液),将研磨液倒入1.5 mL EP管中,振荡混匀,置于冰上10 min,加入氯仿(Trizol液的1/5体积量),盖紧离心管盖,振荡混匀,室温静置5 min,12 000 r/min,4 ℃离心15 min,用移液枪吸取上清液转移至另一新的离心管中,加入等体积的异丙醇,充分混匀后在冰上放置15 min。12 000 r/min,4 ℃离心10 min,小心弃去上清,缓慢沿离心管壁加入体积分数75%的乙醇1 mL洗涤1次,室温干燥沉淀,待乙醇快挥发完时,加入RNase-free水溶解沉淀,待沉淀完全溶解后于-80 ℃保存,并通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的完整性。

第2种方法:采用软骨RNAout柱式提取试剂盒提取软骨总RNA。先将冷冻的软骨组织液氮研磨成粉,加入1 mL溶液A(使用前必须放在65 ℃水浴使沉淀彻底溶解)溶解,然后将研磨物转移到新的1.5 mL离心管中,振荡混合30 s。

在装有研磨物/匀浆物的离心管中加入0.3 mL的溶液B,振荡器振荡30 s混匀(振荡器振荡时必须使管底溶液振荡起来)。加入0.2 mL氯仿,振荡器振荡30 s混匀。室温

12 000-15 000 ×g离心2-5 min。

将上清液(约0.8 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。最好留下100 μL上清液不取。在上清液中加入0.5 mL的溶液C,振荡器振荡30 s混匀。加入0.2 mL的氯仿,振荡器振荡30 s混匀。室温12 000-15 000 ×g离心3 min,两相间将有白色膜状物(蛋白质)形成。

将上清液(约1 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心P.O. Box 10002, Shenyang 110180

孙志涛,等.

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

管中,避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。在上清液中加入0.5倍体积的溶液D,振荡器振荡30 s混匀,此时溶液呈白色浑浊状。室温12 000-15 000×g离心5-10 min,RNA将在管底形成白色沉淀(约黄豆大小)。

表1 RNA吸光度值及产量

Table 1

Absorbance value and yield of RNA

提取 总RNA

A260 A280 A260/A280RNA(g/L)Trizol(第1种方法) 9.670 6.119 1.58 0.386 8

如果组织样品量少或需要提高RNA回收率,也可以延长离心时间到20-30 min。在离心管中加入1 mL体积分数75%的乙醇,振荡器上振荡混匀30 s。室温12 000-15 000 ×g离心5 min,RNA将在管底形成细小沉淀(约芝麻大小)。重复上步体积分数75%的乙醇洗涤1次,RNA将在管底形成细小沉淀。

小心吸弃上清液,注意不要吸弃RNA沉淀。再短暂快速离心,用移液枪小心吸弃残留液。加入适量(一般为20-50 μL)

RNase-free水使RNA沉淀溶解,并通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的完整性。

第3种方法:采用RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit试剂盒提取软骨总RNA。

第4种方法:采用传统Trizol法提取大鼠肝细胞组织RNA,具体步骤同第一种方法。

RNA样品纯度、浓度及完整性检测:分别取各组样品总RNA 1 μL,用核酸蛋白分析仪测定RNA样品核酸的吸光度值A260、蛋白质的吸光值A280(以无RNase水为空白调零),每样品重复3次,取其平均值,并计算A260/A280值;另取总RNA约10 μL,加入Loading buffer,65 ℃加热3 min,冰浴后,在1%琼脂糖凝胶上电泳,凝胶成像仪拍照,观察28 s、18 s条带及5 s条带是否存在及各条带亮度来检测样品RNA的完整性。

cDNA合成与转化生长因子β1 mRNA RT-PCR扩增:按照TaKaRa公司的PrimeScript®RT reagent Kit With

gDNA Eraser说明书进行,以合成的单链cDNA为模板,选择β-actin作为内参照,对转化生长因子β1 mRNA进行PCR扩增。

引物序列:

转化生长因子

β1 mRNA 上游引物5’-GGA CTC TCC ACC TGC AAG

AC-3’;

下游引物5’-GAC TGG CGA GCC TTA GTT

TG-3’,

片段长度为100 bp

β-actin

上游引物5’-CCG CAT CCT CTT CCT CCC

T-3’(19 bp);

下游引物5’-GCC ACA GGA TTC CAT ACC

CAG-3’(21 bp),

片段长度为131 bp

按以下条件进行PCR扩增:94 ℃预变性3 min,94 ℃预变性45 s,56 ℃复性60 s,72 ℃延伸1.5 min,扩增35个循环,72 ℃延伸1 min,4 ℃保存。

主要观察指标:测定各组总RNA A值,琼脂糖凝胶电泳检测各组总RNA的完整性,并通过RT-PCR检测转化生长因子β1 mRNA的表达。

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

RNAout(

第2种方法) 7.740 3.940 1.96 0.309 6

RNeasy

® Mini Kit(第3种方法) 12.882 6.415 2.00 0.546 1

肝(Trizol)(第4种方法) 136.648 68.813 1.98 5.625 9

2 结果 Results

2.1 总RNA纯度、浓度及完整性检测 3种方法提取的总RNA经过核酸蛋白分析仪检测,准确计算RNA的产率和纯度,吸光度值和产量见表1。

高质量RNA的A260/A280值应介于1.8-2.0之间,越接近2.0,说明RNA的纯度越高。从表1中可以看出Trizol法提取的RNA的A260/A280值为1.58,说明其方法提取RNA的纯度不高;RNAout法提取的RNA,虽然A260/A280值为1.96,理论上应该为较纯的RNA,但由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原,其提取的RNA也不能满足后续实验的需要;RNeasy® Mini Kit法和肝(Trizol)法提取RNA的A260/A280值分别为2.00和1.98,说明提取的总RNA或核酸(包括总RNA和DNA)的纯度高。

2.2 总RNA的完整性的琼脂糖凝胶电泳检测 图1为4种提取方法总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳,检测RNA完整性电泳图,结果显示,RNeasy® Mini Kit法、RNAout法和肝(Trizol)法电泳结果可见28 s、18 s及5 s条带,而Trizol法提取的RNA基本上全部降解,未见任何条带,其中RNeasy®

Mini Kit法和肝(Trizol)法的28 s∶18 s为2∶1左右,而RNAout法28 s和18 s条带不清楚,其比值约为1∶1。

2.3 转化生长因子β1 mRNA RT-PCR检测 取5 μL PCR产物及5 μL DNA Marker,在1%的琼脂糖凝胶上样电泳,凝胶成像系统分析电泳结果(图2)。由图2可以看出RNeasy® Mini Kit法提取的RNA,扩增出所需要的目的基因条带,且未见其他特异性扩增产物,而Trizol法提取的RNA,完全不能扩增出目的条带。

3 讨论 Discussion

通过本次实验,作者觉得研究者在对软骨进行RNA提取时,应该注意以下几点:①软骨的取材和保存:在取材过程中,应对所有与软骨接触的物件进行去RNA酶处理,手术器械必须经高温消毒,180 ℃,4 h的高温消毒是可靠的,而且,对所取下的软骨应立即用液氮保存来运输或立即放入-80 ℃保存。②正确的匀浆方法:本实验表明,为了分离到高质量的RNA,软骨一定要在液氮中研磨成粉,在加入裂解液后,要细细匀浆,直至2 mL的注射器能够完全吸取匀浆液,匀浆的是否彻底也是保证RNA提取成功的关键步骤之一。③试剂的选择:本实验发现传统的Trizol法并不能有效的提取软骨中的RNA,这可能是由于软骨中本身细胞含量少,并且含有大量的糖类和胶原类物质,影

8203孙志涛,等.

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

bp 1 2 3 4

2 000

1 000

750

500

250

100

图1 SD大鼠膝关节软骨组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图

Figure 1 Agarose gel electrophoresis pattern of total RNA

extracted from the cartilage tissue of Sprague-Dawley rats

图注:

1:RNeasy® Mini Kit法;2:RNAout法;3:Trizol法;4:肝(Trizol法)。Trizol法提取的RNA未见任何条带,RNeasy®

Mini Kit法和肝(Trizol)

法的28 s∶18 s为2∶1左右,而RNAout法28 s和18 s条带不清楚,其比值约为1∶1。

响了RNA的释放,而基于无苯酚/氯仿柱式提取法的RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit提取的总RNA质量较高,能够满足后续试验需要。

在对文献的研究中作者发现,国内外一些学者对动物各组织总RNA的提取已做过一些相关研究。张磊等[7]使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q法),NucliSens miniMag系统(M法)和匹基(PG)丙型肝炎病毒定量试剂盒自带RNA提取方法(P法)进行血清HCV RNA提取研究,结果发现,从提取效率和收获RNA质量上看,M和Q法远远优于P法,进一步方法性能表明,M法为HCVRNA定量最佳提取方法,而P法因其提取效率低、收获RNA质量差以及重复性不好,不适合临床HCV RNA定量试验。郭俊良等[8]利用改良的异硫氰酸胍法、改良的SDS法和改良的TRlpure试剂盒法对昆明小鼠心脏、肝脏以及肾脏进行组织总RNA的提取进行了研究,结果发现,试剂盒提取效果普遍明显优于其他方法,且适用于肝脏总RNA的提取,传统方法的改良适用于肾脏总RNA的提取,心脏总RNA的提取效果均不理想。进一步采用剪刀剪碎法、研钵加液氮研磨法、离心柱法对心肌组织总RNA的提取研究发现,研磨法提取出的总RNA量大,质量可靠,而剪碎法对于一些实验条件较差的地区仍然是一种可取的方法,其中过柱法对于少量心肌组织的提取较为适合[9]。以上这些研究均表明,在提取各组织总RNA时,一定要考虑到每种组织的差异性,选择合适的方法才能提取到所需要的总RNA,以期为后续实验提供基础。

在软骨组织总RNA提取方面,国内报道的文献多见于使用Trizol方法提取[10-14],只有几篇涉及到软骨组织提取方法的比较研究,其中刘玉刚等[15]通过采用一步法、Trizol法、plantRNAout法和一步法结合plantRNAout法4种方法,对兔膝关节软骨组织总RNA的提取进行了相关比较研究,8204

www.

bp 1 2 3 4

2 000

1 000

750

500

250

100

图2 转化生长因子β1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

Figure 2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR products of

transforming growth factor β1

图注:1:RNeasy® Mini Kit法;2:RNAout法;3:Trizol法;4:肝(Trizol法)。RNeasy® Mini Kit法提取的RNA,扩增出所需要的目的基因条带,且未见其他特异性扩增产物。

他们得出了与传统文献报道的提取软骨组织总RNA方法不同的观点:一步法、Trizol法、plantRNAout法获得的总RNA均含有蛋白多糖污染或DNA污染,不能满足实验需要,用一步法结合plantRNAout法提取的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,能成功反转录合成双链cDNA。在国外报道中,有学者曾使用非Trizol法和试剂来提取软骨RNA[15-18],虽然均报道提取成功,但这些研究未能提供足够的证据来说明所提取RNA的完整性和质量,另外,Smale等[19]运用三氟醋酸铯溶液梯度离心法先分离蛋白多糖与RNA,逐步沉淀RNA,也成功从软骨组织提取总RNA。Geyer等[20]报道的采用无苯酚/氯仿的方法也成功的从软骨中提取到了质量高的总RNA。而Mallein-Gerin等[21]在提取关节软骨总RNA时,把蛋白酶K加入到裂解液中,先使蛋白多糖分解,再除去蛋白酶,其获取的总RNA完成了后续的RT-PCR。McKenna等[22]在实验中发现,应用植物RNA提取试剂能够防止蛋白多糖污染,然后再用DNA酶消除DNA污染,其所获得的总RNA能够满足后续实验需要。上述这些方法在裂解软骨时均加入其他试剂,且步骤繁琐,提取时间较长,无疑都增加了总RNA被RNA酶污染的机会,也增加了RNA降解的机会。因此,如何寻求一种快速、简便的关节软骨总RNA提取方法至关重要。

所以,从目前研究结果来看,作者认为,以往国内文献报道的采用传统Trizol法来提取大鼠软骨RNA的方法欠妥,其法所提取的RNA的纯度和完整性满足不了后续实验的要求,这可能由于软骨组织中只含有少量的细胞和大量的细胞外基质分子所造成,而且大鼠本身膝关节软骨组织量比较少,其组织特殊性要求在提取RNA时一定要采用合适的方法,方能得到满意的结果,虽然刘玉刚等报道的一步法结合plantRNAout法提取的总RNA效果好,但是,其操作相对复杂,而本次实验采用RNeasy® Lipid Tissue Mini

P.O. Box 10002, Shenyang 110180 孙志涛,等.

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

Kit法提取的软骨RNA,不仅操作简单,整个操作过程只需15 min左右,而且其纯度和完整性较好,为后续实验的成功奠定了基础。

作者贡献:设计、评估为第一作者,实施为全体作者,均受过专业培训,第一作者成文并对文章负责。

利益冲突:文章及内容不涉及相关利益冲突。

伦理要求:没有与相关伦理道德冲突的内容。

学术术语:RNase酶-非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

作者声明:文章为原创作品,无抄袭剽窃,无泄密及署名和专利争议,内容及数据真实,文责自负。

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本文标签: 软骨提取膝关节方法组织